承揽前文,接下来根本讲解第三代测序别的技术。

第三代测序别的技术

测序别的技术在近两三年中又有经典路肩。以PacBio住的地方的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单手测序别的技术,被称之为第三代测序别的技术。与前两代相较于,彼此最大的防松动装置即单手测序,测序颠末不需时常PCR扩增。

有一点PacBio SMRT别的技术当真也发动了边电离边测序的行为,并以SMRT芯片为测序媒体。一般性经过是: DNA丛集酶和版块成婚,4色磷光表明 4 种碱基(即是dNTP),在碱基性欲动态,有差异碱基的加入,会撰写出有差异光,根据光的风浪与峰值可归纳前进的碱基大型。此外某 DNA 丛集酶是而让超长读长的要害之一,读长根本跟酶的活力持久干,它根本受荧光对其形成的危害所打扰。PacBio SMRT别的技术的份要害是怎样将反响指令与近旁游离碱基的强悍磷光大团圆甄别大伙们喜欢。彼此利用的是ZMW(零模波导孔)经过:如短波炉壁上可觉得的良多汇合小孔。小孔同心圆有考试前,假如心圆大概是短波风浪,热量可能会在衍射效应的效益下穿透面板而吹风大伙们喜欢,故而与近旁小孔来往的打扰。假如孔径不及风浪,热量繁琐辐射到近旁,当是持久线段相(光衍射的经过),故而可起爱护效益。同理,在份反响管(SMRTCell:单手及时反响孔)中有博如此的机械纳米小孔, 即 ZMW(零模波导孔),外径 100多纳米,比测试荧光风浪小(数百纳米),荧光从后头打看上去后不可穿透小孔前进上方溶休区,热量被限制在份小羁绊(自己的身高体重20X 10-21 L)里,刚好短少笼盖须要测试的部门,促使指令仅得到某小反响处所,孔外无节制游离核苷酸单体仍留在黑有一点,故而而让将大团圆减到最低。此外,可以根据测试上边某些碱基之间的测序时光,来测试多半碱基带帽动态,既假如碱基存续带帽,则根据丛集酶时的极快会抵抗,上边两峰之间的间隔增添,可以根据某来之间测试甲基化等风声(图7)。SMRT别的技术的测序极快一不留神就,每秒约10个dNTP。然而,此外其测序毛病率比很高(这几近是就现在而言,单手测序别的技术的缺欠),到达15%,但没想到它的犯错是随意的,并繁琐像第二点代测序别的技术那样热情存续测序毛病的减下来,可见可以根据屡次测序来时常有用的纠错。

图7.PacBio SMRT测序经过

Oxford Nanopore Technologies住的地方所开采的纳米单手测序别的技术与往常的测序别的技术皆有差异,它是依据电指令而并不光指令的测序别的技术5。该别的技术的要害之一是,彼此创造了一项极其的纳米孔,孔内共价成婚有手讨论。当DNA碱基根据纳米孔时,人家使电通量爆发转变,故而极其短地打扰流过纳米孔的涡电流强度(多数碱基所打扰的涡电流转变尺寸是有差异的),灵巧的电子设施测试到某转变故而看看所根据的碱基(图8)。

该住的地方在2014基因组植物学别的技术方兴未艾年会(AGBT)上推荐一是款商业化的纳米孔测序仪,引起了科学界的非常大还是。纳米孔测序(和彼第三代测序别的技术)指日可待釜底抽薪就现在而言,测序地址的高出,纳米孔测序的根本防松动装置是:读长很长,大约在数十kb,而100 kb;毛病率就现在而言,处在1%至4%,且是随意毛病,而并不集中在遍历的两头;582可及时遍历;通量十分高(30x人物基因组指日可待在一次内到达);开始DNA在测序颠末当中不被打扰;以及样式制备异常快又自制。理论上,它也可直测序RNA。

纳米孔单手测序总计另有另一大防松动装置,它可以或许直读抽出来甲基化的胞嘧啶,而不消像风俗办法那样热情对基因组时常bisulfite高明。这相较于在基因组实力直大放厥词表观驯化相干标有非常大的互惠。此外改办法的测序准确性最高可达99.8%,况且一出现认为测序毛病也可较容易地时常调整。但就现在而言,若还没有发动该别的技术的相干报导。

图8. 纳米孔测序

彼测序别的技术

就现在而言,另有一项依据绝缘体芯片的新一代改造性测序别的技术——Ion Torrent6。该别的技术使用了一项布满小孔的高频率绝缘体芯片, 份小孔即份测序反响池。当DNA丛集酶把核苷酸丛集到扩展中的DNA链上时,会释缓解份氢光子,反响池中的PH爆发改掉,地址在池下的光子交感神经感遭到H+光子指令,H+光子指令再直转化为582指令,故而读出DNA流水作业(图9)。这一别的技术的创造人此外因此454测序别的技术的创造人之一——Jonathan Rothberg,它的丛谈和样张制备跟454别的技术很像,而能够说即454的样张,可是测序颠末当中并不根据测试焦王水磷光显色,当是根据测试H+指令的转变来失掉流水作业碱基风声。Ion Torrent相较于于彼测序别的技术而言,不需求昂贵的物理成像等设施,鉴于,产品成本相对而言会低,自己的身高体重也可能会比略小,此外选择也可能会更多异常快,极快也异常极快,把2天丛谈复制时光,完全上机测序可在2-3.5月内到达,不外完全芯片的通量并很一般,就现在而言,是10G驾御,但异常可以于小基因组和外显子论证的测序。

图9. Ion Torrent


2016年07月07日

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